Το κτίσιμο της μορφής του ναού που διατηρείται έως και σήμερα δρομολογήθηκε από τον αυτοκράτορα Ιουστινιανό Α’. Ως αρχιτέκτονες του ναού ορίστηκαν οι Μικρασιάτες γεωμέτρες Ανθέμιος από τις Τράλλεις και Ισίδωρος από τη Μίλητο. Η κατασκευή του ολοκληρώθηκε σε μικρό χρονικό διάστημα και τα εγκαίνιά του τελέστηκαν στις 27 Δεκεμβρίου του 537. Τότε, σύμφωνα με το θρύλο, ο Ιουστινιανός αναφώνησε «Δόξα τω Θεώ τω καταξιώσαντί με τοιούτον έργον επιτελέσαι. Νενίκηκά σε, Σολομόν!», θέλοντας έτσι να εκφράσει το θαυμασμό του για το μνημείο το οποίο ήταν πιο θαυμαστό από τον Ναό του Σολομώντα στα Ιεροσόλυμα. Τριακόσια και πλέον εκατομμύρια χρυσών δραχμών, κατ΄ αντιστοιχία, είχαν δαπανηθεί για την ανέγερση αυτού του Ναού. Τα “θυρανοίξια” της Αγιάς Σοφιάς ακολούθησαν διανομές χιλιάδων ελαφιών, βοών, προβάτων και ορνίθων και χιλιάδων μοδίων σίτου στους φτωχούς καθώς και πολυήμερη πανήγυρη.

Στο προαύλιο του ναού λέγεται πως υπήρχε κρήνη, στην οποία ανεγράφετο η καρκινική φράση «ΝΙΨΟΝΑΝΟΜΗΜΑΤΑΜΗΜΟΝΑΝΟΨΙΝ» (νίψον ανομήματα μη μόναν όψιν, δηλ. ξέπλυνε τις αμαρτίες σου και όχι μόνο το πρόσωπό σου). Η φράση αυτή, αν αναγνωσθεί ανάποδα (από δεξιά προς τα αριστερά) αποδίδει τις ίδιες λέξεις και επομένως και το αυτό νόημα.

Την εποχή του Ιουστινιανού, η Αγία Σοφία είχε χίλιους κληρικούς. Η νεαρά του Ηρακλείου, που βασίλεψε τον έβδομο αιώνα μας αναφέρει:

Πρεσβυτέρους … 80
Διακόνους … 150
Διακόνισσες … 40
Υποδιάκονους … 70
Αναγνώστες … 160
Ψάλτες … 25
Θυρωρούς … 75

Σύνολο: 600

Ο αριθμός των κληρικών είχε ελαττωθεί κατά τα τελευταία έτη του κράτους, όταν τα εισοδήματα της εκκλησίας αρκούσαν μόλις για τη φωταψία του ναού.